Quando i “metodi alternativi” esistono ma non vengono utilizzati: il caso del test dei pirogeni

“L’uso di animali a fini sperimentali è consentito nei casi in cui non esista un metodo alternativo soddisfacente” (Direttiva 2010/63/CE — protezione degli animali utilizzati a fini scientifici). Purtroppo di fatto non è sempre così. Vediamo un esempio significativo, il test dei pirogeni.

I pirogeni costituiscono un gruppo eterogeneo composto da contaminanti di origine microbica e non. Le sostanze pirogene nei prodotti farmaceutici possono indurre reazioni febbrili anche di grave entità mettendo a rischio la vita del paziente, pertanto, è essenziale garantire la loro totale assenza.

Per assicurare l’assenza di sostanze pirogene i metodi principalmente utilizzati sono il test dei pirogeni sui conigli (RPT) e il Limulus Amebocyte Lysate test. Entrambi i metodi sono limitati nella loro applicazione in quanto non possono fornire risultati validi in assoluto. Il RPT soffre di diverse limitazioni legate alla specie-specificità delle risposte e non è efficace per nuove importanti terapie come i prodotti cellulari [1], mentre il LAL test individua soltanto una classe di pirogeni (le endotossine (1)): in questo modo resta il rischio per i pazienti rappresentato dai pirogeni diversi dalle endotossine (es. esotossine (2)), i virus e i funghi. Inoltre entrambi i metodi impiegano animali vivi o derivati biologici. In particolare, il test RPT prevede l’infusione endovenosa delle sostanze da testare nei conigli e la registrazione seriale delle modifiche della temperatura corporea degli animali. Per questo test, che rappresenta attualmente il gold standard, vengono utilizzati circa 400 mila conigli all’anno in tutto il mondo [2-4].

Test dei pirogeni su conigli

Il saggio del lisato di amebociti di limulus LAL si basa sulla coagulazione dell’emolinfa (3) dei limuli (Limulus polyphemus), degli artropodi simili ai granchi. Anche se non si tratta propriamente di un test in vivo ed il limulo non rientra nella definizione di “animale” per la Direttiva Europea (4), il LAL ha un elevato impatto ecologico. L’impiego su larga scala del test LAL in vitro richiede infatti una notevole produzione di lisato e ciò determina ancora oggi il prelievo di massa dell’emolinfa dagli individui vivi. L’emolinfa, materia prima del test, viene estratta dai limuli, senza provocarne la morte. Esemplari selvatici vengono catturati e portati nei laboratori. Il 30% dell’emolinfa degli animali viene drenata attraverso un ago inserito nel cuore [5]. Quando il processo è completo, i granchi vengono restituiti al mare. Dal 10 al 30 per cento dei soggetti utilizzati muore, mentre molti manifestano alterazioni fisiologiche e comportamentali, con conseguenze sulla riproduzione ed impatto negativo sulla conservazione della specie. Vengono prelevati oltre 500 mila animali annualmente e la specie è in declino nelle zone di prelievo [6,7].

Prelievo dell’emolinfa dai limuli

Monocyte Activation Test (MAT): il test human-based

Nel 2010 è stato introdotto nella farmacopea europea (EP capitolo 2.6.30) il Monocyte Activation Test o test di attivazione monocitaria (MAT). Il MAT permette la determinazione dell’attività pirogena di una soluzione o di una sospensione, quantificando la produzione di interleuchine (5), da parte di monociti (6) umani o linee cellulari ingegnerizzate. Il MAT riproduce in vitro la risposta immunitaria umana, indotta dalla presenza di pirogeni. Il test è stato sottoposto ad una validazione internazionale, coordinata da ECVAM, il centro europeo di riferimento per la validazione dei metodi alternativi, nel 2005 [8].

I risultati dello studio di convalida del MAT indicano che i test in vivo possono essere completamente sostituiti in conformità quindi alla normativa e alle linee guida internazionali. Da allora l’applicabilità del MAT è stata verificata per diverse situazioni con ottimi risultati [3,9-15]. A differenza del LAL, i nuovi test non si limitano unicamente alle endotossine da batteri gram-negativi, ma individuano tutte le classi di pirogeni e rivelano la presenza di diverse endotossine, senza subire interferenze derivanti da componenti leganti le endotossine dei prodotti ematici garantendo cosi la sicurezza del paziente. Inoltre il MAT comporta ulteriori significativi vantaggi: è meno complicato dal punto di vista tecnico ed è più sensibile rispetto al RPT.

Nonostante ciò, ad oggi, i test che impiegano animali o loro derivati per rilevare i pirogeni, sono i più utilizzati , mentre solo pochi laboratori hanno adottato i test human-based.

I motivi sono i più diversi e vanno dalla semplice ignoranza verso l’esistenza del metodo, alla resistenza al cambiamento (si è sempre fatto così e continuiamo così), alla diffidenza verso il nuovo (e se poi non funziona? E se i risultati non venissero accettati?), alla mancanza di armonizzazione delle linee guida in diversi paesi [14,16,17]. Non sorprende che esista una certa ignoranza verso l’esistenza o l’applicazione dei metodi innovativi human-based , visto che ad oggi questi ultimi non vengono né esplicitamente richiesti, né viene sanzionato l’eventuale utilizzo dell’animale (o suo derivato) nel caso delle alternative animal-free siano disponibili.

Glossario:

1. Endotossine: tossine microbiche che fanno parte integrante della cellula batterica, in particolare dei microrganismi gram-.

2. Esotossine: tossine microbiche sintetizzate in forma solubile da molti batteri, in particolar modo dai Gram+.

3. Emolinfa: tessuto fluido che svolge negli artropodi (crostacei, insetti, ragni, ecc.) le funzioni analoghe a quelle del sangue e della linfa dei Vertebrati.

4. La Direttiva 2010/63/CE — protezione degli animali utilizzati a fini scientifici, definisce misure destinate a proteggere gli animali utilizzati per fini scientifici. Si applica a tutti gli animali vertebrati vivi non umani, nonché ad alcuni invertebrati che provano l’esperienza del dolore (seppie, polpi).

5. Interleuchine: molecole prodotte dal sistema immunitario con la funzione di comunicazione tra le cellule coinvolte nei complessi meccanismi di difesa dell’organismo.

6. Monociti: un tipo di globuli bianchi che svolgono più ruoli nell’ambito delle nostre difese immunitarie.

Riferimenti bibliografici

1. Vipond, C.; Findlay, L.; Feavers, I.; Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex 2016, 33, 47-53, doi:10.14573/altex.1509291.

2. Borton, L.K.; Coleman, K.P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex 2018, 35, 453-463, doi:10.14573/altex.1709221.

3. Hartung, T. The human whole blood pyrogen test – lessons learned in twenty years. Altex 2015, 32, 79-100, doi:10.14573/altex.1503241.

4. Valentini, S.; Santoro, G.; Baffetta, F.; Franceschi, S.; Paludi, M.; Brandini, E.; Gherardini, L.; Serruto, D.; Capecchi, B. Monocyte-activation test to reliably measure the pyrogenic content of a vaccine: An in vitro pyrogen test to overcome in vivo limitations. Vaccine 2019, 37, 3754-3760, doi:10.1016/j.vaccine.2018.10.082.

5. Armstrong, P.; Conrad, M. Blood collection from the American horseshoe crab, Limulus polyphemus. J Vis Exp 2008, 10.3791/958, 958, doi:10.3791/958.

6. Anderson, R.L.; Watson, W.H., 3rd; Chabot, C.C. Sublethal behavioral and physiological effects of the biomedical bleeding process on the American horseshoe crab, Limulus polyphemus. Biol Bull 2013, 225, 137-151, doi:10.1086/BBLv225n3p137.

7. Maloney, T.; Phelan, R.; Simmons, N. Saving the horseshoe crab: A synthetic alternative to horseshoe crab blood for endotoxin detection. PLOS Biology 2018, 16, e2006607, doi:10.1371/journal.pbio.2006607.

8. Ecvam. MAT Validation. Availabe online: https://tsar.jrc.ec.europa.eu/test-method/tm2002-05 (accessed on

9. de Mattos, K.A.; Navega, E.C.A.; Silva, V.F.; Almeida, A.S.; da Silva, C.C.; Presgrave, O.A.F.; Junior, D.; Delgado, I.F. Applicability of the Monocyte Activation Test (MAT) in the quality control of the 17DD yellow fever vaccine. Alternatives to laboratory animals : ATLA 2018, 46, 23-37, doi:10.1177/026119291804600107.

10. Fernandes Silva, V.; da Silva Guedes Junior, D.; da Silveira, I.A.; Santos Almeida, A.; de Paiva Conte, F.; Fernandes Delgado, I.; Caldeira Silva, C.; Franca Presgrave, O.A.; Antunes de Mattos, K. A comparison of pyrogen detection tests in the quality control of meningococcal conjugate vaccines: The applicability of the Monocyte Activation Test. Alternatives to laboratory animals : ATLA 2018, 46, 255-272, doi:10.1177/026119291804600506.

11. da Silva, C.C.; Presgrave, O.A.; Hartung, T.; de Moraes, A.M.; Delgado, I.F. Applicability of the Monocyte Activation Test (MAT) for hyperimmune sera in the routine of the quality control laboratory: Comparison with the Rabbit Pyrogen Test (RPT). Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA 2016, 32, 70-75, doi:10.1016/j.tiv.2015.12.004.

12. Pardo-Ruiz, Z.; Menendez-Sardinas, D.E.; Pacios-Michelena, A.; Gabilondo-Ramirez, T.; Montero-Alejo, V.; Perdomo-Morales, R. Soluble beta-(1,3)-glucans enhance LPS-induced response in the monocyte activation test, but inhibit LPS-mediated febrile response in rabbits: Implications for pyrogenicity tests. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences 2016, 81, 18-26, doi:10.1016/j.ejps.2015.09.018.

13. Perdomo-Morales, R.; Pardo-Ruiz, Z.; Spreitzer, I.; Lagarto, A.; Montag, T. Monocyte activation test (MAT) reliably detects pyrogens in parenteral formulations of human serum albumin. Altex 2011, 28, 227-235, doi:10.14573/altex.2011.3.227.

14. Hasiwa, N.; Daneshian, M.; Bruegger, P.; Fennrich, S.; Hochadel, A.; Hoffmann, S.; Rivera-Mariani, F.E.; Rockel, C.; Schindler, S.; Spreitzer, I., et al. Evidence for the detection of non-endotoxin pyrogens by the whole blood monocyte activation test. Altex 2013, 30, 169-208, doi:10.14573/altex.2013.2.169.

15. Daneshian, M.; von Aulock, S.; Hartung, T. Assessment of pyrogenic contaminations with validated human whole-blood assay. Nature protocols 2009, 4, 1709-1721, doi:10.1038/nprot.2009.159.

16. Gimenes, I.; Caldeira, C.; Presgrave, O.A.; de Moura, W.C.; Villas Boas, M.H. Assessment of pyrogenic response of lipoteichoic acid by the monocyte activation test and the rabbit pyrogen test. Regulatory toxicology and pharmacology : RTP 2015, 73, 356-360, doi:10.1016/j.yrtph.2015.07.025.

17. Rovida, C. Food for thought … why no new in vitro tests will be done for REACH by registrants. Altex 2010, 27, 175-183.

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