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Metodi di ricerca human-based //

Esistono diverse tecnologie di ricerca human-based consolidate, che svolgono già un ruolo importante nello sviluppo degli interventi terapeutici.

I notevoli progressi nelle biotecnologie, nella microingegneria, microfluidica, informatica, nella potenza di calcolo e nella rispettiva cooperazione multidisciplinare, hanno consentito lo sviluppo di nuove tecnologie e approcci, inaccessibili solo fino a pochi anni fa.

Le opzioni per lo studio delle malattie umane negli esseri umani sono in costante crescita e sono sempre più supportate, da solidi finanziamenti scientifici e, sempre più, commerciali e governativi. Se questo è vero per la maggior parte dei Paesi europei, purtroppo non è altrettanto per l'Italia, che tende a rimanere indietro. Segue una breve descrizione delle principali metodologie human-based al servizio della ricerca biomedica, che utilizzate in modo integrato rappresentano degli strumenti imprescindibili per affrontare al meglio le sfide del XXI secolo. 

TECNICHE DI IMAGING / SCANSIONE AVANZATE                 Guarda video

Esiste una vasta gamma di tecnologie di scansione che possono rivelare i processi in vivo, in modo non invasivo, negli esseri umani. Le immagini prodotte ad elevatissima risoluzione sono particolarmente utili nello studio del cervello, delle malattie neurodegenerative  come il morbo di Parkinson e l'Alzheimer. Alcuni esempi sono la Risonanza Magnetica (MRI) la Risonanza magnetica funzionale, (fMRI), la tomografia assiale computerizzata (TAC) con ricostruzione tridimensionale, la tomografia ed emissione di positroni (PET). Queste tecnologie, che possono essere combinate tra loro o con altre tecniche, permettono di studiare in modo non invasivo non solo le strutture anatomiche ma anche la composizione biochimica ed il metabolismo dei vari organi.

TESSUTI RICOSTITUITI IN VITRO / INGEGNERIA TISSUTALE

I tessuti umani possono essere anche ricostituiti in vitro a partire dai singoli tipi cellulari, mirando a riprodurre l’architettura originaria del tessuto in vivo. Grazie ai recenti sviluppi delle nelle tecniche di stampa 3D, è possibile la ricostituzione di diversi tessuti umani con un livello di precisione elevato, per la ricerca scientifica.

Esempi di tessuti ricostituiti in 3D sono l’epidermide, l’epitelio corneale, orale e gengivale, l’epitelio vaginale e delle vie respiratorie. L’ingegneria tissutale è la scienza che studia la possibilità di rigenerare organi e tessuti del corpo umano. Sebbene in origine sia nata a scopi terapeutici (rigenerazione/sostituzione di tessuti o organi danneggiati), negli ultimi anni sta assumendo una grande importanza nello sviluppo di modelli sperimentali human-based per la ricerca. Sono stati già creati in laboratorio diversi tessuti o sistemi quali ad esempio il linfonodo umano o l'articolazione.

TESSUTI ED ORGANI UMANI

Le materie prime di origine umana possono essere ottenute e utilizzate in vari modi, dalla donazione post mortem, a quella in vivo (es. DNA, sangue). Fettine intatte di tessuto umano, ottenute eticamente da pazienti sottoposti ad interventi chirurgici o biopsie, possono essere mantenute in laboratorio in modo che preservino la loro funzione. Le biopsie tumorali, ad esempio, possono essere utilizzate per vedere se un farmaco si è legato al target molecolare previsto. Il confronto tra organi donati, sani e malati può fornire importanti informazioni sui processi patologici. Anche le cellule staminali di origine umana hanno un'enorme utilità nella ricerca.

CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE (iPSCs)

Le cellule staminali pluripotenti sono cellule "immature" in grado di differenziarsi nei diversi tipi cellulari che compongono l'organismo. Visto che normalmente questo tipo di cellule si trova all'interno dell'embrione ai primi stadi di sviluppo, fino a non molti anni fa, per l'ottenimento di cellule staminali pluripotenti umane sarebbe stato necessario distruggere degli embrioni umani; ciò ne limitava molto l'utilizzo per questioni etiche. Grazie alle scoperte del gruppo del Prof. Yamanaka dell'Università di Kyoto (Giappone, 2007), oggi le iPSCs possono essere ricavate direttamente a partire dalle cellule del paziente, ad esempio quelle del derma della pelle e differenziate in una grande quantità di tipi cellulari del corpo umano (come ad esempio cellule neuronali, pancreatiche, cardiache ed epatiche), senza dover ricorrere agli embrioni. Spesso la ricerca è limitata dalla difficoltà di accesso a pazienti e dalla ridotta disponibilità di tessuti freschi. Le iPSCs possono essere impiegate quali fonti per la produzione indefinita di tutti quei tipi cellulari altrimenti inaccessibili o a limitata sopravvivenza. Inoltre con le iPSCs è possibile fare qualcosa che non è mai stato possibile fare nella storia della ricerca biomedica: ottenere virtualmente tutti i tipi cellulari dallo stesso paziente. Dato che le iPSCs hanno gli stessi geni e mutazioni dei pazienti dai quali provengono, i ricercatori possono usare le iPSCs per ricreare le malattie in laboratorio e studiare come la genetica di un paziente e le condizioni ambientali contribuiscano alla sua malattia, aprendo le porte ad una nuova era nella medicina personalizzata.

ORGANOIDI UMANI

Un organoide è un cluster cellulare in vitro in 3D, una versione semplificata e su scala ridotta di un organo, che ne ricapitola l’architettura e la funzione negli aspetti più salienti.

Un organoide ha una complessa struttura multicellulare dove le cellule, quando sottoposte ad adeguati stimoli biochimici in vitro, si differenziano, si auto–assemblano e si auto–organizzano in tessuti, ricapitolando ciò che accade nell’embrione nelle prime settimane di sviluppo. Essi possono trovare impiego in:
- studio del meccanismo regolatorio dell’organogenesi;
- modellizzazione dei disturbi umani:
a) malattie infettive;
b) malattie ereditarie;
c) neoplasie.
- test di tossicità ed efficacia farmacologica;
- medicina personalizzata;
Sono stati sviluppati diversi tipi di organoidi, tra cui quelli cerebrali.

Gli organoidi possono essere prodotti a partire dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), ricavate dai pazienti. 

BIOREATTORI FLUIDICI 

 

Sono sistemi in vitro avanzati che grazie alla presenza di un circuito fluidico e di una pompa peristaltica permettono l’interazione dinamica tra colture e co–colture cellulari, alloggiate in camere o moduli, collegati tra loro. Ogni modulo rappresenta un organo del corpo umano e connettendo i moduli tra loro in serie o in parallelo attraverso un circuito fluidico che mima il flusso sanguigno è possibile modellare l’interazione tra organi e sistemi similmente a quanto accadrebbe in vivo. 

SISTEMI MICROFISIOLOGICI 

Il concetto di sistema microfisiologico (organi su chip, corpo umano su chip) si è recentemente evoluto ed è descritto come un sistema di colture cellulari, ognuna a rappresentare un tessuto o un organo che interagiscono tra loro a diversi livelli su un microchip, attraverso un circuito microfluidico, in condizioni strettamente controllate.  Grazie ai sensori integrati, è possibile il monitoraggio in tempo reale delle risposte cellulari agli stimoli meccanici o chimici con un controllo più preciso dell’ambiente cellulare rispetto ai metodi convenzionali. Il sistema permette di mimare le interazioni tra cellule, tessuti (organ on a chip) ed addirittura organi e sistemi diversi (human on a chip), e di fornire gli stimoli meccanici, strutturali e biochimici adeguati, riproducendo a tutti i livelli ciò che accadrebbe in vivo. L’utilizzo di cellule prelevate dal singolo paziente per l’assemblaggio di human on a chip personalizzati rappresenta una delle più grandi promesse per il prossimo futuro della medicina.

SCIENZE "OMICHE"

Le scienze “omiche” si occupano dello studio di pool di molecole biologiche (es.acidi nucleici, proteine, enzimi) in determinati campioni biologici (per esempio, siero, urine, liquor, saliva, tessuti). Esse analizzano, nel loro insieme: (a) i geni del DNA (genomica) e le loro funzioni (genomica funzionale); (b) i trascritti del DNA, cioè l’RNA (trascrittomica); (c) le proteine (proteomica); (d) i metaboliti all’interno di un organismo (metabolomica). Studiano anche le interazioni tra queste molecole (interattomica) e tra queste molecole ed i fattori ambientali (esposomica), i nutrienti (nutrigenomica), i fattori epigenetici (epigenomica), ecc.  Lo scopo di tale approccio olistico è quello di poter comprendere operando con approcci integrativi, principi operativi di livello più elevato, che nel complesso definiscono la biologia dei sistemi. Ciò al fine di potere rispondere a domande biologiche gerarchicamente più complicate (per esempio, patogenesi, storia naturale o successo terapeutico e prognosi di una malattia). Si avvalgono dell’impiego di tecniche di analisi genetica comparativa (array-CGH) o di variazioni del numero di copie di determinati tratti del DNA (CNV) o di sequenziamento del DNA o computazionali che analizzano dati di decine, centinaia o migliaia di molecole/campioni.

METODI COMPUTAZIONALI 

 

I sistemi umani, dai singoli organi a tutto il corpo, possono essere simulati utilizzando programmi informatici altamente sofisticati. Questi vengono creati utilizzando i dati ottenuti dalle persone. Simulazioni al computer sono state sviluppate, ad esempio, per prevedere il comportamento di un farmaco nel sistema digestivo. È probabile che queste simulazioni prevedano tali effetti nell'uomo in modo più accurato rispetto ai modelli animali e in un modo molto più efficiente.

MICRODOSING

Una delle caratteristiche più importanti di un candidato farmaco è il suo profilo farmacocinetico, ovvero il modo in cui il farmaco viene assorbito, distribuito, metabolizzato, escreto dall’organismo umano. Purtroppo i dati farmacocinetici forniti dai modelli preclinici tradizionali, che siano in vitro o in vivo (modelli animali) spesso non sono affidabili, in quanto non rilevanti per la biologia umana. Non a caso, la maggiore causa di fallimento nello sviluppo dei farmaci viene attribuita all’incapacità di ottenere precocemente dati farmacocinetici rilevanti per l’uomo. Concentrazioni troppo basse di farmaco a livello dell’organo target, per un tempo troppo breve, possono essere causa di inefficacia mentre concentrazioni troppo elevate, per un tempo troppo lungo, potrebbero indurre effetti tossici.
Un approccio sperimentale utile a superare questi problemi è il microdosing, che consiste nella somministrazione a volontari sani di dosi estremamente piccole, non attive farmacologicamente, di un determinato farmaco per stabilirne il profilo farmacocinetico nell’uomo. Il microdosing si basa su tecnologie analitiche ultrasensibili capaci di misurare quantità e concentrazioni infinitesimali (dell’ordine del picogrammo o del femtogrammo, cioè un billionesimo di grammo e un un milionesimo di miliardesimo di grammo!) di farmaco e di metaboliti. Le tecnologie più utilizzate a questo scopo sono la cromatografia liquida in associazione con la spettrometria di massa in tandem, la spettrometria di massa ultrasensibile con acceleratore e la tomografia ad emissione di positroni (PET).

DATI CLINICI

I dati clinici e l'osservazione sono sottoutilizzati in modo sistematico, tra cui le informazioni raccolte da procedure non invasive (come il prelievo di sangue o di urine). I dati di questo tipo di intervento, su pazienti consenzienti che devono sottoporsi a determinate procedure mediche, potrebbero essere raccolti in modo molto più efficiente di quanto non avvenga attualmente.

EPIDEMIOLOGIA

L'epidemiologia comporta lo studio di un numero significativo di persone per un periodo di anni, confrontando stili di vita, geni, interventi medici, ambiente, stato sociale, ecc. Rimane uno strumento potente con un enorme potenziale e ha già prodotto risultati estremamente preziosi, tra cui il legame tra fumo e cancro ai polmoni.

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Alcuni esempi di applicazione dei metodi sopra descritti per la ricerca su:

Alzheimer

TECNICHE DI IMAGING / SCANSIONE AVANZATE

 

La risonanza magnetica (MRI) è uno strumento di ricerca e diagnostica ampiamente utilizzato nei disturbi neurologici. La risonanza magnetica funzionale (fMRI) è una scansione specializzata in grado di misurare i cambiamenti nel flusso sanguigno correlati all'attività neurale. Può essere utilizzato per studiare le alterazioni della funzione cerebrale correlate ai primi sintomi della malattia di Alzheimer, possibilmente prima dello sviluppo di un danno strutturale irreversibile significativo.

Il Neuroimaging Research Group dell'Università di Aston, Birmingham (UK), sta esplorando metodologie avanzate human-based per lo studio del cervello, del comportamento e delle proprietà dei farmaci. Viene impiegata la magnetoencefalografia (MEG), che permette di eseguire misurazioni neurologiche dirette nei soggetti umani. Fornisce misurazioni temporali 1000 volte più precise di una scansione fMRI.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26401997

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27324149

https://www.meguk.ac.uk/meg-labs/aston-university-meg-lab/

TESSUTI ED ORGANI UMANI

 

L'utilizzo di tessuti ex vivo derivati da biopsie di pazienti, campioni di sangue, campioni di liquido cerebrospinale, tessuti collezionati post-mortem (dopo il decesso del paziente) può permettere l'identificazione di biomarcatori della patologia. 

I materiali umani più utili per la ricerca sull'Alzheimer sono i cervelli donati, sia da pazienti che da individui sani. Esiste, in UK, una rete di "banche del cervello" per fornire i tessuti alla ricerca neuroscientifica. Brains for Dementia Research (finanziato congiuntamente dall'Alzheimer's Society e dall'Alzheimer's Research UK) aiuta a raccogliere i cervelli dagli individui che sono stati monitorati regolarmente durante la loro vita. Gli studi possono quindi correlare i cambiamenti cellulari e chimici con i sintomi clinici pre-mortem. Possono essere condotti studi genetici su larga scala e possono essere implementati test che darebbero una maggiore precisione nella diagnosi.

Come riconosce il dott. John Xuereb (direttore della Cambridge Brain Bank dal 1991-2002): "L'Alzheimer, il Parkinson e altre malattie neurodegenerative si verificano nell'uomo ed è nel tessuto umano che troveremo le risposte a queste malattie".

http://www.brainsfordementiaresearch.org.uk/

CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE (iPSCs) E ORGANOIDI 

 

Le iPSCs possono essere ottenute direttamente dai pazienti e convertite in neuroni. Tali cellule si possono coltivare in vitro anche in strutture tridimensionali (organoidi), e hanno permesso in anni recenti d'identificare nuovi possibili candidati terapeutici per il trattamento dell'Alzheimer.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30664937

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26323533

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5021368/

SISTEMI MICROFISIOLOGICI

I sistemi microfisiologici (organi su chip) possono essere utilizzati per riprodurre in modo più fedele alcune strutture tissutali del cervello, permettendo un'analisi più realistica dei processi fisiologici e patologici. Grazie ad un modello microfluidico recentemente sviluppato, è stato possibile ricapitolare e studiare il ruolo della barriera emato-encefalica nella patogenesi dell'Alzheimer.

https://www.nature.com/articles/s41593-018-0175-4

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.201900962

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28881425

MODELLI COMPUTAZIONALI

https://www.humanbrainproject.eu/en/

DATI CLINICI / EPIDEMIOLOGIA

Vi sono numerosissime pubblicazioni scientifiche che riportano analisi di tipo osservazionale, epidemiologico e interventistico, direttamente condotte nei pazienti affetti dalla patologia, e che rappresentano un bacino di dati essenziali per lo studio dell'Alzheimer.

Gli studi di associazione a livello del genoma, in cui vengono analizzati e confrontati i dati genetici di grandi popolazioni, possono offrire nuove informazioni sulle cause sottostanti la malattia di Alzheimer. 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24371799

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29555333

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26868820

https://www.nature.com/articles/s41588-018-0311-9

Cancro

TECNICHE DI IMAGING / SCANSIONE AVANZATE

hanno un ruolo essenziale nella diagnosi e nel trattamento della stragrande maggioranza dei tumori maligni. È stato dimostrato che una diagnosi precoce migliora la sopravvivenza in molti tipi di cancro.

La spettroscopia di risonanza magnetica (MRS), può fornire informazioni sulla biochimica dei tessuti viventi. Ha applicazioni sia nella ricerca che nel trattamento: migliorare l'accuratezza della diagnosi della lesione, ad esempio, o monitorare la risposta a nuove terapie per il cancro negli studi clinici. L'MRS è stata ampiamente utilizzata nelle indagini sul carcinoma mammario, cerebrale e prostatico. Con l'avvento degli scanner per imaging PET / MRI combinati, stiamo entrando in un'era in cui le relazioni tra i diversi elementi del metabolismo tumorale possono essere esplorate simultaneamente attraverso l'imaging RM multimodale e l'imaging PET.

https://breast-cancer-research.biomedcentral.com/articles/10.1186/bcr3132

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1978163/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26294301

TESSUTI ED ORGANI UMANI

Il materiale bioptico da tumori umani è molto utile per la ricerca e come modello di screening riproducibile per identificare nuovi biomarcatori e testare nuove terapie in singoli campioni di tumore.

https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/1756-9966-28-127

TESSUTI RICOSTITUITI IN VITRO 

ORGANOIDI

SISTEMI MICROFISIOLOGICI

SCIENZE OMICHE

MODELLI COMPUTAZIONALI

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S193652331830113X

DATI CLINICI / EPIDEMIOLOGIA 

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